富血小板血纤蛋白与其他生物材料联合用于牙周组织修复

[摘要]富血小板血纤蛋白（PRF）独特的三维空间架构，赋予其较大的内表面积，非常有利于生长因子的黏附和细胞的迁移，自身大量的内源性生长因子使其对组织细胞的生长分化有较强的促进作用。其特殊的缓释特性使其非常适宜作为生物支架材料。PRF可较大程度地促进骨髓基质干细胞增生、矿化及其向成骨细胞向分化，抑制破骨细胞的形成。PRF与骨成分、纤维胶原蛋白类成分和细胞复合的联合应用，可明显增强成骨细胞、牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞的生长，促进软组织缺损修复和再生。上述研究成果为PRF与其他生物成分或人工材料在组织缺损修复方面的联合应用奠定了理论依据，然而PRF促进组织愈合的具体机制还有待于进一步研究。

[关键词]富血小板血纤蛋白；组织再生；细胞因子；生物支架材料

[中图分类号]Q 51 [文献标志码]A [doi] 10.7518/gjkq.2015.02.026

将自患者血浆溶液中提取的活化血小板和生长因子被覆在纤维凝胶上，则会形成一定的血小板凝聚物，这种凝集物被称作富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP），但是在制备PRP的过程中，黏附的纤维组织需要加入氯化钙和异种凝血酶才可以使得血小板得到最大程度的聚集，其生长因子得以活化，这就导致了PRP有诱发交叉感染和宿主免疫反应的可能性。相对于PRP而言，富血小板血纤蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）在制备过程中不需添加异体凝血酶和抗凝剂，其成分完全源于患者自身血液，也就消除了免疫反应和交叉感染的危险。PRF制备简单、成本低廉和安全性高，被称为第2代血小板凝聚物。

1 PRF支架的特性

浓缩的PRP之间的连接为双边相连呈链状结构，四分子呈十字形交叉，这种交叉和链状的结构使得PRP自身的架构比较僵硬，形态上不具有多变性；同时，链状结构决定其分子之间的有效面积和承载能力有限。PRF纤维结构问的联系为三分子相连，T字型交叉，交叉之间形成的等边形的网状形态，赋予了PRF支架较大的内表面积，这也使得PRF支架非常有利于生长因子的黏附和细胞的迁移。

PRF内含有大量的转化生长因子（transfor-ming growth factor，TGF）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）等有利于组织修复的生长因子。其中，TGF-β1在体内介导纤维基质组织的重建，促进纤维化胶原分泌；PDGF是间叶组织细胞系内的一种调节因子，可刺激细胞增生和迁移。有研究者分别应用PRF和PRP培养成骨细胞发现：第14天时PRF释放的PDGF-AB和第7天释放的TGF-B1达到顶峰；第14天时，PRF组细胞的矿化程度和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性达到顶峰；PRP只在第1天释放了一定量的PDGF-AB和TGF-β1。

PRF制备时的缓慢聚合过程有利于生长因子植入PRF基质。在体内应用时，生长因子随着PRF的缓慢降解并逐渐释放到机体内，大大地延长了生长因子的作用时间。相对于PRP而言，PRF拥有更持久的促进组织修复和愈合的作用，这种与其特殊结构相关的缓释特性，也使得PRF更适用于作为生物支架材料。

PRF独特的三维空间架构，较PRP和纤维蛋白凝胶更有利于细胞因子的包被和聚集，其独特的聚合和降解过程使得细胞因子和生长因子有更长的存活寿命和作用时间，其自身大量的内源性生长因子使其对组织细胞的生长分化有较强的促进作用。这些特性大大地增加了PRF作为生物支架材料的潜能。

2 PRF促牙周组织生长的机制

Honda等发现，L-PRF可明显提升骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cell，BMSC）中AKP与骨桥蛋白的表达，进而促进该细胞向成骨细胞的分化。L-PRF与BMSC联合使用相对于单纯应用浓缩生长因子（concentrate growth factor，CGF），可大幅缩短大鼠头盖骨缺损的愈合时间并提升骨量。较低质量浓度的L-PRF可较大程度地促进BMSC增生、矿化及其向成骨细胞向分化。Wu等发现：PRF可增强成骨细胞样细胞（U20S细胞）中蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）的磷酸化，而磷酸化的蛋白激酶B则可抑制核因子-κB受体活化因子配体介导的破骨细胞向分化，从而抑制破骨细胞的形成；PRF可明显上调U20S细胞中热休克蛋白47和脂氧化酶（lipoxygenase，LOX）的表达，而热休克蛋白47和LOX二者皆可促进胶原性细胞外基质的形成并增强成骨细胞的附着。Chang等发现，PRF可增强U2OS细胞中细胞外信号调节激酶的磷酸化并提升骨保护蛋白（osteoprotegerin，OPG）表达，但是PRF对核因子-κB受体活化因子配体的表达却没有明显影响。杨世茂等认为，OPG和细胞外信号调节激酶表达增强预示PRF有增强新骨形成的作用。

Zhao等在研究中发现：7 d内PRF可明显地促进PDLSC的生长；PRF可通过上调牙周膜纤维蛋白的主要成分胶原蛋白1和牙骨质蛋白23的表达，很好地促进牙周膜细胞形成胶原组织并促进牙骨质形成；PRF也可抑制AKP的活性，降低骨涎蛋白和骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）的表达，以避免PDLSC过多分化为成骨细胞，从而减少胶原蛋白的形成。Huang等发现：PRF可明显提升牙髓细胞的增殖能力；在相位相差显微镜下，牙髓细胞大量附着于PRF的边缘。他们认为，PRF独特的三维构架很好地支持了牙髓细胞的增殖，PRF可随着作用时间的延长而逐渐提高牙髓细胞中OPG和AKP的表达，促进牙髓细胞形成骨成分的作用。

3 PRF与其他生物材料的联合应用

3.1 PRF与骨成分的联合应用

3.1.1 PRF与患者自身骨移植的联合应用Kocyigit等取患者自身耻骨联合处骨块联合应用PRF，3个月内将1名罹患严重牙周病患者的牙槽骨高度增加了11 mm，新骨骨质致密，耐受垂直骨劈开术并且成功植入3枚种植体。Vadal/L等应用PRF包被患者自身髂骨及骨髓干细胞，移植于患者骨质疏松被吸收的颈椎棘突处，棘突处骨质得以持续再生。

Kuo等应用PRF包被的家兔自身软骨颗粒处理家兔膝盖软骨缺损模型，对照组不加任何处理，3个月后，试验组的国际软骨修复软骨损伤分级评分明显高于对照组，两组之间软骨细胞的数目及软骨矿化程度有明显差异。他们认为，PRF对于软骨颗粒中细胞的生长和新软骨形成有明显的促进作用，软骨颗粒可作为合适的支架材料。

3.1.2 PRF与异体骨和骨产品的联合移植针对严重的牙槽骨缺损患者，成熟的引导骨组织再生技术可补充其缺损的骨量，术者通常都将生物可降解纤维材料如Bio-Oss胶原膜联合患者自身或异体骨成分共同移植。其中，胶原膜主要起到封闭结合上皮，阻止结缔组织向术区骨缺损区域生长的作用。PRF不仅拥有前者的屏障作用，同时内含大量促缺损区骨组织再生的生长因子，因此学者们一直尝试用其作为胶原膜的替代材料。

Zhang等在11个经上颌窦提升的牙槽窝中选择6个应用PRF混合的Bio-oss骨粉进行充填，对照组的5个牙槽窝仅应用Bio-Oss骨粉。术后6个月，PRF组的新骨形成率高出对照组40%，PRF组新骨和残余骨之间的交联也明显高于对照组。有学者选取23例牙槽突残余量不足5 mm并做上颌窦提升的患者，在提升的牙槽窝内应用PRF包裹的Bio-Oss骨粉，术区软硬组织均成功增量，无一例失败。该试验也进一步验证了PRF包被骨材料联合应用时，可以加速骨材料的新骨形成效率。

Lekovic等发现针对严重牙周组织缺损患者，相对于联合应用PRF和胎牛骨粉的试验组，单纯应用PRF的对照组组织再生的情况明显不足，牙槽窝内硬组织新生程度明显低于试验组。他们认为，PRF自身缺乏修复牙周组织缺损的物质基础，如联合骨粉等原材料，会更有利于PRF发挥其促进组织再生的作用。

3.1.3 PRF与磷酸三钙的联合应用 磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）以其良好的生物相容性、生物活性和生物降解性，一直在生物医学工程学领域受到人们的广泛关注。β-TCP与骨基质的无机成分相似，与骨组织有较高的结合效率。诸多细胞都可在β-TCP材料上健康生长、分化和繁殖。有学者证了β-TCP与第一代血小板凝集物PRP混合支架材料的成骨促进能力。

Jayalakshmi等将PRF和β-TCP联合应用于慢性根尖周囊肿，术后每3个月复查根尖片发现，PRF和β-TCP联合应用组术区较单纯PRF组和单纯β-TCP组根尖周骨质恢复情况更好。联合应用PRF和β-TCP，不仅可加速牙槽窝伤口的愈合，也有利于骨支架的稳定并有更好的止血作用。Kim等证实PRF包被的TCP支架材料，长期成骨效果明显强于重组人骨形态发生蛋白（bone morphogeneticprotein，BMP）-2和TCP的混合支架材料。

3.2 PRF与纤维胶原蛋白类成分的联合应用

纤维蛋白胶原主要由凝血酶浓缩物和纤维蛋白原组成，在这两种成分混合时，可模拟凝血反应的最后一步，但纤维蛋白胶原内缺乏促进组织生长的必要生长因子。近来，许多学者也联合PRF与纤维胶原蛋白以修复硬组织缺损。

Lee等应用PRF包被且经酸处理过的小相对分子质量的丝蛋白（<1 0×10³）填补白兔顶骨直径9 mm的缺损，对照组不加任何材料，镜下观察12周后，试验组组织矿物质含量、矿化密度和新骨形成量都较对照组有明显提高，显微CT扫描结果与镜下观察结果一致。Yang等从未萌出的小型猪的第二磨牙牙蕾中获取牙蕾细胞，然后将猪自身牙蕾细胞经由纤维蛋白胶原和PRF共同包被并悬置回拔牙窝，36周后，其中一只小型猪长出一颗完整的结构和血管分布均与健康牙一致的牙；另有一只小型猪发育出一颗未萌出牙，该未萌出牙可以表达细胞角蛋白-14、牙本质基质蛋白-1、血管内皮生长因子和骨桥蛋白。他们认为，以PRF加纤维蛋白胶原混合支架可以使小型猪体内牙蕾细胞较好地生长并发挥生物活性的作用，甚至发掘牙蕾细胞再生出完整牙的潜能。

将PRF与丝蛋白混合物植入种植体周围的缺损组织内，可以明显提升种植体50%的抗力和抗扭矩能力。Chien等发现相对于单纯应用生物可降解纤维结合蛋白，PRF与纤维结合蛋白混合应用可明显提高支架周围组织的BMP-2、IGF-1和PDGF等生长因子的质量，尤其是TGF-β1的质量提升更加明显，混合支架明显改善了SW1353细胞的增生和分化作用。他们认为，PRF内含有的TGF-β1和BMP-2等生长因子可明显刺激软骨细胞的分化和增生，PRF自身的三维构架有利于软骨细胞的移行和附着。

3.3 PRF与细胞的复合应用

PRF三分子相连的等边形微观结构与其缓慢的聚合过程相关，这种结构使得PRF内部的表面积和空间得以提升，增加了细胞在其上的附着和迁移能力。有学者也因此将PRF作为细胞的支架材料应用于缺损模型中。研究显示：PRF可在3 d内明显增强成骨细胞、牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞的生长，在一定程度上抑制口腔上皮细胞增生；在相位相差显微镜下，可以观察到大量的成骨细胞、牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞附着在PRF的边缘。研究还显示，PRF可通过上调OPG和OCN的表达，促进成骨细胞的新骨形成，即便采用1/3的比例稀释的PRF培养基，仍可明显提高SaOS₂细胞的增生。相较于Biogide胶原膜，PRF有着更好地促进成骨细胞增殖和分化的作用，更有利于成骨细胞生化活性的发挥；这些特性主要跟PRF来源于血液，与诸多有利于成骨细胞生长的因子相关。

Dohan等应用PRF培养BMSC，在培养的第1周，PRF成剂量依赖性地促进BMSC的增殖和分化，这种剂量依赖性的针对BMSC的分化过程全程都起作用，并且第14天PRF组细胞内含有更多的矿化小结。郭延伟等发现，BMSC-PRF复合材料组的成骨速度及其质量，明显优于单纯应用BMSC组。

PRF不仅对硬组织生成相关细胞，更对软组织相关细胞有较为明显的生物效应。Liu等将30只新西兰白兔分成4组，分别在其耳廓下植入脂肪颗粒（adipose granule，AG）、基质血管成分（stromal vascular fraction，SVF）、AG+PRF、AG+PRF+SVF，观察PRF和SVF对脂肪组织形成的影响。结果显示，AG+SVF+PRF组的AG与临界组织的连接更加紧密，组织微血管密度更高，术后AG+PRF+SVF组植入体吸收程度明显小于其他组别。他们认为，AG+SVF+PRF植入为脂肪组织提供了一个良好的环境，对细胞的增殖和组织微血管化都有较好的促进作用。

4 结语

在组织缺损修复过程中，PRF不仅可以起到屏蔽上皮组织和包被缓释修复材料的作用，而且其自身也是一种修复材料的储存库和生长因子的释放源。有关促进组织愈合的机制，一些学者证实，PRF可从多种通路促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞形成，促进AKP和OCN等成骨相关因子的表达，促进PDLSC胶原纤维的形成以修复软组织缺损，刺激成牙骨质细胞分化，以达到刺激牙周组织再生，促进受损伤的牙周组织愈合的目的。这些发现，为PRF与其他生物成分或人工材料在组织缺损修复方面的联合应用提供了理论依据。虽然PRF作为生物支架材料修复组织缺损潜力巨大，然而PRF促进组织愈合的更多具体机制，还有待于进一步研究和完善。

（本文采编 王晴）