SRAP标记在夏华2号甘蓝种子纯度检测中的应用

摘 要： 应用SRAP技术对夏华2号甘蓝种子纯度进行了分子检测研究。结果表明，从100对SRAP引物中筛选出1对引物（Me-5/Em-8）能清晰地扩增出父、母本的特异性条带，并且F1代带型呈双亲互补。利用这对SRAP引物对夏华2号种子进行纯度检测，检测纯度为97%，与田间生物学性状表现相符合，表明SRAP技术可用于夏华2号甘蓝种子纯度鉴定。

关键词： 甘蓝； 夏华2号； SRAP； 种子纯度

Genetic Purity Test of Cabbage Xiahua No. 2 Using SRAP Markers

HUANG Jian-du， SHAO Gui-rong， CHEN Wen-hui， FANG Shu-gui， ZHONG Kai-qin

（Fuzhou Vegetable Research Institute， Fuzhou， Fujian， 350111， China）

Abstract： This experiment was conducted to test the genetic purity of cabbage hybrid Xiahua No. 2 by using SRAP markers. A pair of primers（Me-5/Em-8）produced polymorphism between the parents and repeatable co-dominant bands, among 100 pairs of SRAP primers tested. The genetic purity 97% of a seed lot of hybrid Xiahua No. 2 revealed by the SRAP markers is very similar to the result of field grown-out test. The results showed that the SRAP markers can be used in genetic purity test of cabbage hybrid Xiahua No. 2.

Key words： Cabbage（Brassica oleracea var. capitata）； Xiahua No. 2； SRAP； Seed Purity

夏华2号是福州市蔬菜科学研究所选育的甘蓝新品种，表现出生长强势整齐、结球性好、抗病、高产等优点，深受广大菜农的喜爱。该品种于2011年通过福建省农作物品种审定委员会认定（闽认菜2011009）。为了确保种子质量，销售前必须对种子进行纯度检测，传统上对种子的检测方法是利用田间生物学性状进行鉴定，但是采用此方法周期长且容易受到外界环境的影响，可靠性较低。

随着分子标记技术不断发展，已有RAPD [1-3]、AFLP[4-5]、SRAP[3，6]分子标记应用于种子纯度的鉴定。利用分子标记技术对种子纯度进行鉴定是基于DNA水平上的鉴定，可以从本质上反映亲本之间以及亲本与子代之间的差异，且不受外界环境因素的影响，可快速、准确地应用于种子纯度的鉴定。SRAP是由Li 和 Quiros[7]于2001年提出并发展的一种新型分子标记，具有操作简单、中等产量、高共显性、高重复性、在基因组中分布均匀、易于分离条带及测序等优点，被广泛应用于多种作物的种子纯度鉴定。本研究利用SRAP技术对甘蓝新品种夏华2号种子纯度进行分析鉴定和研究，结合田间生物学性状观察结果，拟为夏华2号甘蓝提供一种快速、准确、实用、可靠的检测方法，也可为其他甘蓝品种种子纯度鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为本所甘蓝课题选育的新品种夏华2号及其父、母本，其中母本是细胞质雄性不育系NBB10-87，父本是优良自交系107-1。Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR buffer（含Mg2+）、DL-2000 marker等试剂购自上海申能博彩生物公司，SRAP引物根据Li和Quiros[7]的设计原理，由上海生物技术工程有限公司合成，引物序列见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 甘蓝育苗及DNA的提取与检测 2011年4月将供试品种夏华2号甘蓝及其父、母本进行穴盘育苗并用遮阳网覆盖避光，待真叶长至2~3片时，随机抽取夏华2号甘蓝及其父、母本各15株，摘取展开的健康嫩叶，并混合，采用改良的CTAB法[8]提取总DNA，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，用紫外分光光度计在260 nm和280 nm下测定OD值，检测DNA的质量和浓度，并稀释到30 ng·μL-1作为PCR扩增的模板。

1.2.2 SRAP-PCR反应体系 SRAP-PCR反应体系参考单晓政等的反应体系[9]：总体积为25 μL，包含10×PCR buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTP 0.25 mmol·L-1，上下游引物各0.4 μmol·L-1，Taq polymerase 1.5 U，DNA 30 ng，不足的部分由ddH2O补充。PCR扩增程序参考刘冲等[10]的方法：94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 变性1 min，35 ℃ 退火1min，72 ℃ 延伸1.5 min，5个循环；94 ℃ 变性1min，50 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共35个循环；72 ℃ 延伸10 min；4 ℃ 保存。PCR扩增产物电泳分析检测用2% 琼脂糖，电泳电压为120 V，时间 80 min，最后在凝胶成像系统中进行检测拍照。

1.2.3 多态性引物的筛选 利用夏华2号甘蓝及其父、母本的混合DNA对100对SRAP引物对进行筛选，筛选出条带清晰的多态性引物用于种子纯度鉴定。

1.2.4 田间种植鉴定与分子标记鉴定 将同批次夏华2号及其父、母本种子于2011年6月播种在福州市闽侯县大洋乡高山反季节蔬菜基地（海拔700 m）。幼苗期随机选取200株进行编号，利用筛选出的SRAP特异引物对甘蓝幼苗进行SRAP-PCR扩增检测，并将幼苗及其父、母本定植于大田中。至9月中旬采收期，参照甘蓝种质资源描述规范与技术规程[11]测量夏华2号甘蓝及其父母本的外叶数量、开展度、生育期、蜡粉量、球高、球宽以及中心柱。

2 结果与分析

2.1 多态性引物筛选

利用混合DNA对SRAP的10个上游引物（Me1-Me10）和10个下游引物（Em1-Em9和Em12）组成的100对引物组合进行扩增筛选，图1为12对SRAP 引物对甘蓝扩增的指纹图谱。结果表明，大部分的SRAP引物均能在250~2 000 bp扩增出条带，平均每条引物扩增出的清晰条带数目为4~5条。选择条带较为清晰并且条带数量较多的引物对夏华2号甘蓝及其父、母本进行SRAP扩增，结果选出5对可以扩增出夏华2号甘蓝及其父、母的特异性条带的引物，分别为Me3/Em2、Me4/Em3、Me5/Em8 、Me8/Em6和Me9/Em7（表2）。

表2 不同SRAP引物对扩增多态性

2.2 甘蓝的特异性标记

利用筛选出的5对引物组合对夏华2号甘蓝及其父、母本同时进行扩增，扩增结果表明，每对引物最少能扩增出1条父本或母本的多态性条带，其中Me3/Em2表现出偏父性，Me4/Em3、 Me8/Em6和Me9/Em7表现出偏母性，Me5/Em8能扩增出父母本互补的带型。经过多次扩增反复试验，Me5/Em8扩增图谱差异很少，说明引物可靠性和稳定性较高，Me5/Em8在650 bp左右有母本和F1代特异性条带，为偏母型；在1 000 bp左右有父本和F1代特异性条带，为偏父型（图2），由此可以同时鉴别出父本、母本和F1代。

2.3 SRAP标记与田间种植鉴定结果的比较

利用引物Me5/Em8对200株夏华2号甘蓝进行SRAP分子标记检测。结果表明，有5个扩增产物有母本特异性条带，但没有父本特异性条带；有1个扩增产物既没有父本特异性条带，也没有母本特异性条带。SRAP检测结果表明夏华2号种子纯度为97%。

将200株夏华2号甘蓝及其父、母本种植于大田中，观察得到其生物学性状如表2。结果显示，在存活的177株夏华2号甘蓝中有8株表现为蜡粉量、球高、球宽和中心柱等性状与夏华2号甘蓝及其亲本的性状均不相同。田间检测结果表明夏华2号种子纯度为95.5%。室内分子鉴定与田间性状观察结果基本一致。

表2 夏华2号甘蓝及其父、母本

主要田间生物学性状比较

3 讨 论

本试验是利用SRAP标记与田间种植2种方法鉴定种子纯度，结果表明夏华2号甘蓝种子纯度均未达到100%，两者的结果基本一致，说明在种子生产过程中出现了混杂，影响到种子的质量。目前在生产上影响种子纯度的因素有很多，包括有授粉过程中窜粉、种子采收后机械混杂、亲本纯度和母本育性的稳定程度等[12]。

本研究对夏华2号种子纯度进行检测过程中发现，田间生物学性状观察结果不但速度慢，而且还会由于环境因素影响，存在死苗缺株现象，影响检测结果；同时无法从表型观察结果判断引起种子纯度下降的原因。而SRAP标记结果显示，影响夏华2号甘蓝种子纯度的主要因素是可能在留种过程中外界甘蓝类蔬菜花粉引起的窜粉，占总混杂比例的66.7%；其次是在种子收获后由其他种子引起的机械混杂，占总混杂比例的33.3%。因此在种子生产过程中首先要严格做好隔离工作，防止外界甘蓝类花粉进入留种地；其次是种子收获后应该正确整理种子，避免不同种子之间相互混杂。本试验研究表明，分子标记技术不仅可以快速、准确地检测种子纯度，而且能够为我们在种子生产环节中的质量控制提供指导。

4 结 论

本研究利用SRAP标记技术对夏华2号甘蓝种子纯度进行鉴定时，从100对SRAP引物中筛选出5对引物可以用于夏华2号甘蓝。其中Me5/Em8可以同时扩增出父本和母本的特异性条带，F1代能同时扩增出父、母本的特异性带型。运用此对引物对苗期夏华2号甘蓝种子纯度进行SRAP鉴定和田间种植采收期的生物学性状观察结果基本相符。

参考文献

[1] 郝风，李成琼，宋明，等. 西园四号甘蓝纯度的RAPD鉴定及其在杂交制种中的应用[J]. 中国农学通报，2006，22（5）： 43-45.

[2] 宋洪元，雷建军，李成琼， 等. 应用RAPD标记鉴定结球甘蓝品种[J]. 西南农业大学学报，2002，24（1）： 38-41.

[3] 于拴仓，柴敏，姜立纲. 主要番茄品种的分子鉴别研究[J]. 中国农学通报，2005，21（5）： 84-89.

[4] 赵丽萍，柳李旺，龚义勤，等. 萝卜品种指纹图谱SRAP与AFLP分析（英文）[J]. 植物研究，2007，27（6）： 687-693.

[5] 王玲平，戴丹丽，吴晓花，等. AFLP分子标记技术在浙蒲2号种子纯度快速鉴定中的应用[J]. 浙江农业学报，2008（2）： 84-87.

[6] 扈新民，李亚利，赵丹，等. 辣椒SRAP分子标记的优化及在航椒4号种子纯度检测中的应用[J]. 长江蔬菜，2010（22）： 7-11.

[7]Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP）， a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet， 2001，103： 455-461.

[8] 王关林，方宏筠. 植物基因工程[M]. 北京： 科学出版社，2002.

[9] 单晓政，侯喜林，李英，等. 不结球白菜SRAP体系优化与品种聚类分析[J]. 江苏农业学报，2009，25（3）： 610-615.

[10] 刘冲，葛才林，任云英，等. SRAP、ISSR技术的优化及在甘蓝类植物种子鉴别中的应用[J]. 生物工程学报，2006，22（4）： 657-661.

[11] 李锡香，方智远. 结球甘蓝种质资源描述规范和数据标准[M]. 北京： 中国农业出版社，2008.

[12] 何霭如，郭建夫，吴星文，等. 利用ISSR标记鉴定杂交水稻种子纯度初步研究[J]. 杂交水稻，2008，23（2）： 70-72.

收稿日期： 2011-11-14

基金项目： 福建省科技计划重大专项专题[2008NZ0002-1（1）]； 福建省科技计划项目（2008N0046）

作者简介： 黄建都，男，研究实习员，研究方向： 蔬菜育种。电话： 15859109091； 电子信箱： hjd_2003@163.com

通讯作者： 陈文辉，男，研究员，电子信箱： CWH1227@126.com