桑树SSR引物的开发及其多态性分析

材料的多态性验证。结果表明，38对SSR引物共扩增出清晰谱带210条，不同引物的扩增条带数1～12条，平均每对引物的扩增带数为5.526 3条；每对引物组合可检测到SSR多样性位点数3～9个，共检测到106个多样性位点；所有位点的平均PIC值为0.645 8；8份供试材料在SSR水平上表现出明显的多态性差异，其中野生品种葫芦桑和岩桑聚为Ⅰ组，遗传距离为0.746 0，栽培品种垂桑、荷叶白、剑持、新一之濑、伦教40、鸡桑聚为Ⅱ组，剑持与荷叶白遗传距离最近（0.169 5），亲缘关系最近，葫芦桑和岩桑与荷叶白的亲缘关系最远。

关键词：桑树（Morus alba L.）；SSR引物；多态性分析

中图分类号：S888 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）11-2824-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.028

桑树（Morus alba L.）属桑科（Moraceae）桑属（Morus L.），是蚕的优良饲料，营养丰富。桑属有许多种及变种，目前，中国有桑树种质资源3 000余份，包括15个桑树种和4个变种，是世界上桑树种最多的国家[1]。桑树的分类基本上是依据花柱、柱头内侧的状况，以及枝、叶、花序和聚花果的大小、性状等的形态特征进行，但有的性状特征极易受到环境等非生物因素的影响，所以有时并不能真实反映桑树种的亲缘关系。随着生物学技术的发展，分子生物学标记技术为物种鉴定、系统演化以及遗传多样性等的研究开辟了新的途径。

DNA指纹技术是一种可检测出大量DNA位点差异的分子生物学技术，在作物品种鉴定、品种注册、纯度检测等方面具有重要作用[2]。SSR分子标记近年来已被广泛应用于水稻、小麦、大麦、大豆、棉花、玉米等作物资源分析、基因定位、杂种亲本鉴定和纯度分析[3-6]。彭波等[7]利用24对SSR引物（其中来自桑树基因组的16对、无花果基因组的8对）对172个桑树品种（系）进行研究，结果表明利用SSR对桑树进行系统研究是可行的。本研究利用FIASCO磁珠富集法开发桑树荷叶白品种的基因组DNA的SSR位点引物，并对这些引物是否能够扩增及其多态性进行验证，以期为桑树遗传图谱的构建、比较基因组结构和功能分析等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的8份桑树种及变种材料均采自安康学院蚕桑基地桑树种质资源圃。具体品种（系）的来源情况见表1。

1.2 方法

1.2.1 桑树基因组DNA提取 采摘各供试桑种质材料的新鲜嫩芽（约0.1 g），用改良CTAB法提取桑树基因组的总DNA。

1.2.2 桑树SSR引物开发

1）限制性酶切及连接。以桑树中的典型代表品种荷叶白作为引物开发试验材料，基因组用MseⅠ进行单酶切。酶切体系40 μL：模板DNA 1 μg，10×T4 DNA ligase Buffer 4 μL，MseⅠ（10 U/μL）1 μL、T4 ligase DNA 酶1 μL，其余用ddH2O补齐。25 ℃作用2 h。

2）预扩增。预扩增做4管，每管的扩增体系和反应程序如下：PCR扩增体系为20 μL，含连接接头的酶切DNA 1 μL、2×PCR mix 10 μL、M00 20 pmol、Taq酶1 U，其余用ddH2O补齐。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30次循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

3）PCR产物纯化。将获得的200 μL PCR产物经试剂盒进行产物纯化。

4）磁珠富集含有SSR位点的片段。用FIASCO磁珠富集法于磁场中收集上清液，将收集到的DNA浓缩后用E00、M00再次进行PCR扩增。

5）阳性克隆的筛选。用pMD18-T载体的通用引物M13-47（CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC）或RV-M（GAGCGGATAACAATTTCACACAGG）与重复序列（AG）9/（GT）9组成的双引物对AG/GT富集文库菌落进行筛选检测。反应体系如下：DNA模板，单菌落（体积为0）；2×PCR Mix 7.5 μL，M13-47/RV-M（20 μmol/μL） 0.15 μL，20 μmol/μL （AG）9/（GT）9 0.15 μL，Taq酶 0.2 μL，ddH2O 7 μL，总体积15 μL。

反应程序：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s， 33次循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，对扩增出清晰电泳条带的菌落进行质粒测序。

6）引物设计。利用Chromas软件查看序列峰图，手工校正序列，并筛选出含有SSR位点的序列。利用DNAman软件去除载体和接头序列，CodonCode Aligner软件进行序列比对分析，去除重复序列后用Primer5软件进行SSR引物设计，并送华大基因生物公司合成。

1.2.3 SSR引物扩增分析 PCR的反应体系20 μL，包括模板DNA 25 ng，10×Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，10 μmol/L F-primer 0.25 μL，10 μmol/L R-primer 0.25 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，其余用ddH2O补齐。

PCR反应程序：预变性94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，变性 30 s，72 ℃ 60 s，72 ℃ 5 min， 32个循环。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳对引物扩增进行检测，选择扩增产物为目的条带且扩增稳定的进行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测。

1.3 数据分析

选取PAGE电泳平板上清晰可辨的电泳条带，以“1”和“0”分别记录条带的“有”和“无”。在相同片段位置上有带记为“1”，无带记为“0”。一个引物为一个等位基因位点，将每个样品在各个等位基因位点的片段大小，即其表现型按照Convert 1.31软件要求的格式录入到Excel中，然后用Convert 1.31软件转化成POPGENE软件所要求格式。用POPGENE32软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 预扩增产物电泳检测

为了获得富集文库，对酶切产物进行预扩增试验，结果如图1。结果表明，预扩增试验获得500 bp左右的扩增产物，引物符合试验要求。

2.2 克隆PCR检测

利用RV-M和（GT）9组成的双引物从构建的2个富集文库进行克隆PCR检测（图2）。结果显示，阳性克隆扩增条带清晰且单一，阳性菌占到检测菌落数的37.5%。

2.3 SSR位点PCR扩增引物的设计及引物评价

在发现SSR位点的基础上，依据其两端的保守序列，设计了46对SSR位点PCR扩增引物（表2）。为了检测所设计的46对引物组合在桑属内PCR扩增的有效性，以表1所列的鸡桑、垂桑、荷叶白、新一之濑、剑持、伦教40、葫芦桑、岩桑8个桑树品种为材料进行PCR扩增，并进行等位位点多样性检测，结果见表3。从表3可以看出，引物SP4、SP12、SP14、SP16、SP17、SP45、SP46在8个样品中均没有扩增到目的片段，引物SP2、SP8和SP28在个别样本中没有扩增到目的片段，引物SP6虽然在琼脂糖中扩增得到目的片段，但扩增条带显影太弱，且不稳定，不适合进行PAGE检测。其他35对引物在8个检测样本中均获得了稳定的目的条带。

从46对引物中筛选出38对有目的条带且扩增稳定的引物用于多态性验证。8份材料的SSR-PCR扩增结果见表4。结果表明，38对SSR引物共扩增出清晰谱带210条，不同引物的扩增带数1～12 条不等，平均每对引物的扩增条带数为5.526 3条，带数最多的为SP11（12条），最少的为SP1和SP24（各1条）；每对引物组合可检测到SSR多样性位点数为3～9个，共检测到106个多样性位点。根据软件POPGENE计算得出观察杂合度值Ho，其中Ho值范围从0（说明无多态性）到1（说明无限多个等位形式具有相同的频率）；所有位点的平均PIC值为0.645 8，最高位0.890 0，最低为0，即除了引物对SP1和SP24之外，其他均为多态性位点。

2.4 SSR位点在桑属系统分类中的应用

SSR电泳结果显示，8份供试材料在SSR水平上表现出明显的多态性差异。按照SSR扩增条带的表型进行聚类分析，结果表明这8份桑材料聚为2簇。从图3和表5可以看出，野生品种葫芦桑和岩桑聚为Ⅰ组，两者遗传距离较近，为0.746 0，遗传相似系数为0.474 3。栽培品种垂桑、荷叶白、剑持、新一之濑、伦教40聚为一枝后，与鸡桑聚为同一簇（Ⅱ组），其中剑持与荷叶白遗传距离最近（0.169 5），遗传相似系数最大（0.844 1）。鸡桑在Ⅱ组中与荷叶白的遗传距离最远（0.959 2），遗传相似系数最小（0.383 2）。即在供试材料中，剑持和荷叶白的亲缘关系最近，葫芦桑和岩桑与荷叶白的亲缘关系最远。

3 小结

桑树SSR引物开发及分析成功的关键是获取高质量的基因组DNA。采用改良CTAB法提取桑树DNA，通过0.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明DNA无降解，带型整齐。选出38对有稳定目的扩增条带的引物用于8份桑树材料的多态性验证，结果表明，38对SSR引物共扩增出清晰谱带210条。不同引物的扩增带数1～12条，平均每个引物的扩增带数为5.526 3条。带数最多的是SP11，为12条；最少的是SP1、SP24，各1条。每对引物组合可检测到SSR多样性位点数为3～9个，共检测到106个多样性位点。所有位点的平均PIC值为0.645 8，最高位0.890 0，最低为0。即除了引物对SP1和SP24之外，其他均为多态性位点。

8份供试材料在SSR水平上表现出明显的多态性差异。野生品种葫芦桑和岩桑聚为Ⅰ组，遗传距离较近，为0.746 0，遗传相似系数为0.474 3；栽培品种垂桑、荷叶白、剑持、新一之濑、伦教40聚在一起后与鸡桑聚为Ⅱ组，其中剑持与荷叶白遗传距离最近（0.169 5），遗传相似系数最大（0.844 1），鸡桑在Ⅱ组中与荷叶白的遗传距离最远（0.959 2），遗传相似系数最小（0.383 2）。即在供试的材料中，剑持和荷叶白的亲缘关系最近，葫芦桑和岩桑与荷叶白的亲缘关系最远。该研究开发的桑树SSR引物将为桑树遗传多样性分析与亲缘关系、种质资源利用、育种群体的建立等奠定基础。

参考文献：

[1] 林寿康，何大彦，施炳坤，等.实用桑树育种[M].成都：四川科学技术出版社，1989.

[2] 王 伟，杨文鹏，张文龙，等.贵州48个玉米杂交种及其亲本SSR指纹图谱的构建与分析[J].贵州农业科学，2009，37（11）：1-8

[3] 李晶召，何 平，李仕贵，等.利用微卫星标记鉴定杂交水稻冈优22种子纯度的研究[J].生物工程学报，2000，16（2）：211-214.

[4] ARNAUD J，FESQUET J，COSTE F，et al. Disriminating between barley genotypes using microsatelite markers[J].Genome， 1997，40（4）：442-450.

[5] 武耀廷，张天真，郭旺珍，等.陆地棉SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究[J].棉花学报，2001，13（3）：131-133.

[6] 番兴明，张世煌，谭 静，等.根据SSR标记划分优质蛋白玉米自交系的杂种优势群[J].作物学报，2003，29（1）：105-110.

[7] 彭 波，胡兴明，邓 文，等.桑树种质资源SSR标记的遗传多样性分析[J].湖北农业科学，2010，49（4）：779-784.