血管组织工程的进展

Vascular tissue engineering

血管病变尤其是冠状动脉的闭塞性病变为人类的主要病死原因之一。其主要的治疗方法是血管搭桥手术,需要各种直径的血管移植物作为修补材料。临床已经应用的血管移植物包括自体血管、异体血管和合成材料管道。然而目前无论那种血管移植物都无法满足临床需要，临床需要一种新的血管替代物，这种管道应具有高度的组织相容性、可生长性及外科易操作性，且应无排异反应、无血栓形成、不易感染等优势,移植后能维持管腔的长期通畅,从而提高血管移植手术的长期疗效。组织工程学的出现为这种血管移植物的研发提供了可能。但血管的组织工程研究仍面临着巨大的挑战：良好的血管替代物要求有足够的强度以免在血压变化时出现破裂；要有弹性来承受循环负荷；要与临近的自体血管有良好的愈合性能；还要有完整健康的内膜层，以防止血栓的形成。目前很多组织工程化的组织，例如骨、软骨等的构建过程依赖于在受体体内随时间推移而逐渐达到组织重塑并最终获得功能，而组织工程化的血管必须在移植的同时就具有完全的结构和功能。这就要求在体外培养出具有生命力和良好性能的血管替代物，因此血管组织工程研究难度大大增加。本文就血管组织工程的进展综述如下：

1组织工程血管移植物研究的历史

实际上，在组织工程概念提出以前，心脏外科和血管外科的临床医生及很多研究人员就已应用某些类似今天组织工程所使用的方法来获得更好的血管替代物。从血管组织工程的发展来看，可以分为以下几个方面：

1.1非降解合成材料表面的内皮化:非降解合成材料人工血管研制成功，使其在大、中动脉代用方面取得较好的效果，但在小口径动脉（<6 mm）和静脉移植上的疗效仍然不佳，这与血管代用物管径细和血流速度缓慢，极易发生血栓栓塞有关。因此人们设想通过组织培养技术使之在人工血管内面实现内皮化，可使此类移植物的功能得到实质性的改进。国内汪忠镐等[1-2]从20世纪80年代就开始了这方面的研究。后来又通过从脂肪组织中来提取微血管内皮细胞。随后干细胞也被诱导分化成为血管内皮细胞，成为内皮种子细胞的来源之一[3-4]。为了提高血管腔内内皮化，人们对血管材料的表面进行了修饰，以期提高内皮细胞在其表面的粘附和生长，包括在表面衣被一些细胞外基质（ECM）蛋白，如RGD、胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等 [5-6]。Deutsch[7]将内皮细胞种植于包被有纤维粘连蛋白的ePTFE后，用于股腘旁路搭桥手术，获得了68%的通畅率。在对ePTFE进行内皮化的时候应用了体外的模拟脉动灌注系统来提高血管内皮化。

但是这种种植内皮细胞的人工血管也存在不可克服的缺点。非降解材料的使用会阻碍正常血管结构的形成，也就是说ePTFE和Dacron等阻碍了血管细胞形成胶原和弹性蛋白。因此，在血管的长期应用过程中这些合成材料将成为物理障碍。同样，由于合成材料的存在，血管活性成分将完全丧失，这种血管不具有正常的舒缩功能，最终因内膜增生而导致堵塞。可以认为，采用非降解材料做支架构建的血管不是真正意义的组织工程血管，只是人造血管的表面改性。

1.2无支架的全细胞生物血管:1998年，L"Heureux等[8]构建了一种全新的完全生物化的组织工程血管。该生物血管是完全用人的细胞生成的。在含有抗坏血酸的培养系统内分别培养平滑肌细胞和成纤维细胞，使分别形成一薄的平滑肌细胞组织片和薄的成纤维细胞组织片，将它们分别缠绕在同一轴上，形成内面是平滑肌细胞层、外面是成纤维细胞层的复合管。再在平滑肌细胞层内表面种植内皮细胞，这样就形成了在结构上与自体血管基本相似的具有三层结构的血管移植物。培养后的这种血管替代物可以承受2 000mmHg的爆破冲击力，还具有生物活性，能表达或分泌LDL、PGI2等物质，非常接近自体血管。短期狗体内植入试验表明其缝合性能良好，植入后这些血管替代物稳定，在植入1周后能保持50%的通畅率。Heureux认为这种全生物化的人工血管之所以能有良好的力学特性，在于它的细胞外基质是培养细胞自己生成的，而且它是一个有生物活性可以自我更新的组织。由于没有合成材料的参与，可以减低感染及机体免疫排斥反应的发生，有利于提高远期通畅率。这个实验提示通过利用细胞特性和给予一定的培养时间可以使生成的血管移植物获得较好的机械强度。但在移植后可观察到有部分出现血栓，同时至少需要12周的时间才能获得该血管替代物也是很大的制约。Heureux的工作于1998年发表后，被很多文献所引用。但至今我们未能查到其后续的文章，也未查到其他人跟进的文章。“无支架”有悖于组织工程学的基本原理，“无支架的全细胞生物血管”是否可行尚待更多实验的验证。

1.3细胞和生物可降解支架相结合的组织工程化血管移植物：目前血管组织工程学的研究主要集中在细胞和生物可降解支架相结合的组织工程化血管移植物上，它包括以下几个方面：种子细胞的获取和扩增；生物可降解支架的研制和改性；生物反应器的设计和应用以及对各种细胞生物学特性和组织培养的全过程调控。

2用于组织工程血管种子细胞的获取、扩增及功能调控

细胞技术是血管组织工程的首要核心技术。在进行组织工程化血管的构建中，不但要有丰富的种子细胞而且细胞要具有正常的功能。

2.1细胞的获取及扩增:自从内皮细胞及平滑肌细胞分离培养获得成功后，自体内皮细胞和平滑肌细胞被广泛应用于血管组织工程的构建。但自体细胞能获取的量远远不能满足需要，而且其扩增的能力有限，在体外培养过程中易出现退化，丧失功能。进而人们希望通过某些生长因子的调控，促进体外细胞扩增。目前已经证实，VEGF、 bFGF及TGF-β 等生长因子对血管内皮细胞有明确的促进增殖和迁徙的作用[9-10]。

尽管生长因子的应用使得体外培养细胞的增殖获得较大的增加，但其调控机制还没有完全弄清楚，其使用的剂量及如何联合使用多种生长因子以达到细胞的增殖需要仍是研究的焦点。可以预见生长因子的应用将是组织工程中必不可少的重要环节，对细胞增殖机制的研究也必将为生长因子的应用带来更为可观的效果。虽然自体细胞没有免疫排斥反应，且研究人员正在应用生长因子及其他方法来促进其增殖，但由于体外扩增的时间过长、细胞容易出现退化等问题，自体细胞目前仍无法满足临床需要，人们将目光集中在干细胞的培养和诱导分化上。目前骨髓基质干细胞向内皮细胞及平滑肌细胞的分化已经获得成功，长期培养的骨髓基质细胞可向血管平滑肌细胞分化，并诱导成平滑肌细胞[11]。然而，干细胞分化为内皮细胞及平滑肌细胞后还需要较长期的培养才能制成功能性血管代用物，时间上的需求限制了临床上很多急需血管代用物患者的应用。为了解决这一问题，Matsumura G等[12]进行了尝试，他们分离提取自体骨髓基质细胞后直接接种于可降解的血管支架上，立即植入患者体内，进行先天性心血管畸形的修复手术。结果显示所有患者均未出现栓塞或动脉瘤破裂等致命并发症。Shin"oka T等[13]也进行了同样的临床研究，获得了较好的效果。他们认为将骨髓基质细胞直接种植于可降解血管支架后直接植入体内是一种理想的血管组织工程方法，有望代替目前常用的人工假体血管用于治疗严重先天性心血管畸形的外科手术。但更长期的临床观察来证明其可行性仍旧是必要的。