影响前脂肪细胞增殖与分化的若干因素

樊芙蓉　综述，刘毅　审校

在脂肪组织工程中，前脂肪细胞是被公认的种子细胞，它是一类具有增殖分化能力的特异化前体细胞，其作用持续于人的一生，与脂肪移植成活率有密切关系。脂肪细胞的增殖分化能力对体外构建脂肪组织起着非常重要的作用，获取足够多的组织并使获得的细胞有较强的增殖能力，是众多研究者期待解决的问题。本文拟就影响脂肪细胞增殖分化的若干因素结合文献综述如下。

1　生长因子类

生长因子是对体内一大类特殊的生物活性物质的统称，它在体内分布广泛，种类多样，作用复杂。生长因子属于多肽类，在与特异性质膜结合后，可启动快速链式反应，最终导致DNA复制和细胞分裂。它的生物学作用较为广泛，参与组织形态学变化的调节，并对细胞分化、迁移及功能活性具有调节作用。近年来，生长因子对前脂肪细胞分化的调控作用已被众多研究成果所证实。

1．1胰岛素样生长因子：Rinderknecht等首次测定了胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factorl，IGF-1)的氨基酸序列及其与胰岛素原的结构同源性，确定了IGF-1为含70个氨基酸的单链蛋白质．天然状态下含3对二硫键，其分子量为7649kDa，并与胰岛素原有明显的同源性。IGF-1因其能介导生长激素的促生长作用，最初被称为促生长介素(somatoedin)，后来发现IGF-1还具有胰岛素的促合成代谢活性。于是命名为类胰岛素样生长因子。IGF-1是一种多功能细胞调控因子，对多种组织器官有生物学作用。IGF-1结构类似胰岛素，可以作用于胰岛素的全部靶组织(包括脂肪组织)，产牛胰岛素样作用。IGF-1对前体脂肪细胞的促进糖摄入作用可以通过胰岛素受体和IGF-1受体发挥作用，而其在人脂肪细胞中的促进脂蛋白脂酶(LPL)活性的作用只能通过IGF-1受体起作用，能被IGF-1受体抗体完全阻断。IGF-1对脂肪分解的作用与浓度有关，高浓度的IGF-1能激活胰岛素受体，发挥抑制脂肪分解作用。而低浓度的IGF-1可以促进脂肪分解。

IGF-1可以促进脂肪细胞、成肌细胞、成骨细胞和其他源自中胚层的细胞的增殖与分化。在血液中它与特异的结合蛋白相结合。IGF-1对汇合前的前体脂肪细胞表现为强烈的促进增殖作用，甚至比胰岛素还强烈。用IGF-1处理鼠棕色脂肪细胞24h后，S+G₂／M期细胞数量、细胞PCNA水平和24hD-NA合成、胸腺嘧啶核苷结合都显著增加，标志着细胞增殖的加强。IGF-1可以提高棕色脂肪细胞中作为分化标志的48h和72h UCP mRNA表达和苹果酸酶(malic enzyme，ME)水平。在大鼠、猪、兔原代前体脂肪细胞培养中均发现IGF-1有促进脂肪合成作用。在大鼠、猪、兔、鸡原代前体脂肪细胞培养中均发现IGF—1可以促进脂肪细胞的分化。Boone报道，IGF-1还可以增加前体脂肪细胞脂质沉积，提高充脂细胞率。而且无论有血清培养还是无血清培养，IGF-1均可以促进前体脂肪细胞的分化。

1．2肿瘤坏死因子α：肿瘤坏死因子α(TNF-α)被证明是一种能调控脂肪代谢的活性蛋白质，自20世纪70年代以来，人们逐渐认识到，TNF-α作为一种调节机体能量平衡的反馈因子对脂肪代谢调控发挥重要作用。研究表明，TNF-α对细胞的增殖起到较好的调控作用。在分子水平，有人用“双信使”学说解释TNF-α对细胞增殖调控的机理。TNF-α生长因子与受体结合，导致受体的酪氨酸磷酸化，进而导致磷酸酰肌醇代谢，引起一系列变化。当生长因子-受体结合物激活了二磷酸肌醇磷脂特异性磷酸酶C，将释放出两种产物—1，2双酰甘油和三磷酸肌醇脂，即“双信使”。1，2双酰甘油是磷酸酯和钙依赖的蛋白激酶C的内源性激活剂，三磷酸肌醇的作用表现在调节钙离子的通透性上，导致钙离子由内质网中释放，改变钙流对细胞增殖分化的激活十分重要。TNF-α能显著抑制脂肪细胞的分化并使发育的脂肪细胞脱脂。TNF-α主要是下调C／EBPα和PPARγ等成脂因子的表达而抑制脂肪的生成。

肿瘤坏死因子2A(Tumor Necrosis Factor2A，TNF2A)可通过诱导脂肪消耗，降低脂肪细胞的基因表达，减弱脂肪正常的生物学功能。并可通过活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，抑制培养的373-L1前脂肪细胞的分化。早期应用TNF2A可阻断前脂肪细胞的克隆增生并最终导致细胞凋亡，阻断克隆增生是通过干扰P130ō P　107转化实现抑制培养的373-L1前脂肪细胞的分化。

肿瘤坏死因子具有多种作用，包括诱导胰岛素抗性、诱导瘦素(leptin)产生、促进脂解、抑制脂合成、导致脂肪细胞正常形态丧失、阻止体外培养的前体脂肪细胞的分化等，这些作用均趋向于降低脂肪细胞的数量和体积，因而7NF具有限制脂肪增长的作用。f310培养中的TA1脂肪细胞用TNF-α处理后，失去细胞质内的脂滴，数天后形似前体脂肪细胞，加入TNF-α几小时后脂肪生成时增多的mRNA退到分化前水平，若要再积聚脂肪则需要外加入激素予以刺激，蛋白质合成亦退到前脂肪细胞水平，以上作用均不伴有细胞增殖。TNF-α可以减少如LPL和乙酞辅酶A梭化酶(acetyl-coenzyme A car-boxylase)等对脂肪生成必需的关键酶的合成或降低酶的活力，或通过抑制GLUT4的表达和／或GLUT4通路的功能而抑制脂肪贮藏。TNF-α对前体脂肪细胞的成脂肪细胞转化的作用与C／EBP α和PPAR Y的表达降低有关最近的研究表明，肿瘤坏死因子转化酶TACE介导的TNF-1外功能区脱落抑制3T3-L1细胞的分化。TACE在脂肪分化方面是主要的蛋白酶。

1．3转化生长因子(Transforming growth factor，TGF)：TGF有TGF-α与TGF-β两种，作用范围相当广泛。TGF抑制脂肪细胞分化可能是通过增加ECM成分的合成来完成的。

TGF-α抑制3T3 F442A和鼠的前脂肪细胞分化，过量表达TGF-α的转基因鼠的体脂减少50％。近年来发现TGF-β对细胞的生长、分化都有重要的调节作用，TGF-β₁、TGF-β₂和TGF-β₃功能相似，一般来说，TGF-β对间充质起源的细胞起刺激作用．而对上皮或神经外胚层来源的细胞起抑制作用。TGF-β对前脂肪细胞的促增殖作用机理尚不清楚，但已有研究表明TGF-β通过抑制前脂肪细胞的肥大生长和脂质填充来抑制原代培养的或者细胞系的前脂肪细胞的分化。在一些前脂肪细胞系中TGF-β必须在分化前或者分化时添加，一旦分化之后，细胞对于GF-β反应降低，不能恢复到未分化状

态。但是在另外一些细胞中，TGF-β可以改变脂肪细胞的形态，或者降低已分化细胞的分化标记基因的表达。TGF-β也可以在体內阻止脂肪形成，高水平表达TGF-β₁的转基因动物蛋白脂(WAT)和棕脂(BA7)都显著减少，并且脂肪细胞不能成功分化。虽然TGF-β抑制脂肪细胞分化，但在培养的脂肪细胞中和活体脂肪组织中均能表达TGF-β，而且肥胖个体体内TGF-β还相对较高。

1．4表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)：EGF是一类重要的生长因子，它是由50～60个氨基酸分子组成的肽链，链中含有6个半胱氨酸分子．半胱氨酸分子间形成稳定的双硫键，使整条肽链成为3个环联部分的活性物质。EGF是通过与细胞膜上的受体结合而发挥作用的。除了造血系统的细胞。几乎所有组织中都有EGF受体表达。当EGF与受体的结合区域结合发生构型变化，胞质内效应部位具有酪氨酸激酶活性，和ATP磷酸化底物结合部位时，在EGF的作用下，受体本身能使酪氨酸自动磷酸化，引起细胞内三磷酸肌醇和二酯酰甘增多，作为第二信使可使细胞内游离Ca²⁺增多，激活蛋白激酶C和环腺苷酶，改变细胞的骨架结构，使细胞分化、分裂和增殖。

EGF主要存在于动物的尿液、乳汁及汗腺中，具有很强的促分裂作用。EGF可以活化CD2K(丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶)，通过CD2K的作用使细胞提前进入S期，使细胞由静止期进入增殖期，促进cDNA复制，推进细胞周期进程，使分裂加快、细胞周期缩短。多项研究均表明EGF可以促进前脂肪细胞增殖。EGF对前脂肪细胞分化的影响，各家众说纷纭。给新生小鼠皮下注射EGF会大量减少脂肪层的重量，说明皮下注射EGF推迟了前脂肪细胞的分化。然而，EGF对在无血清培养下的3T3 L1前脂肪细胞的分化却有促进作用。1991年，Serrero报道NBR新生鼠皮下注射EGF后脂肪垫减少了50％，前脂肪细胞的数量增加，培养时对EGF的抑制作用更加敏感；1992年，Butterwith发现EGF对鸡前体脂肪细胞分化具有抑制作用；ob／ob小鼠体内脂肪组织EGF低于同窝小鼠；还有关于小鼠、人的研究发现EGF对前脂肪细胞分化具有抑制作用。Boone用猪前脂肪细胞发现，EGF可以使LPL、MAE及GPDH等脂肪细胞标志酶活性上升；向分化程序第4天3T3-L1脂肪细胞添加0．1～1 nM EGF10天，可以显著加强乙酞辅酶A合成酶(acyl—Co A synthetase)和脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase，LPL)mRNA表达水平，而这两种酶都是脂肪细胞TG合成的限速酶。1990年，Schmidt在培养基中加入EGF支持前脂肪细胞的分化，结果表明EGF具有矛盾的两阶段作用：抑制前体脂肪细胞分化，促进已经开始分化脂肪细胞的脂肪生成，即促进了该细胞的分化。这使得EGF对前脂肪细胞作用有必要进行进一步研究。

1．5成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)：近年来的研究表明bFGF生物学作用极其广泛，能够刺激靶细胞产生生物效应的多肽或蛋白，是中胚层和神经外胚层细胞的生长刺激剂，可调节其来源细胞的生长和分化。FGF存在两种受体：一类为高亲和力受体，属酪氨酸蛋白激酶类受体：另一类为低亲和力受体，即肝素类受体。FGF的受体后信息通过酪氨酸蛋白激酶系统进行传递。FGF与高亲和力受体结合成二聚体，使受体的胞内酪氨酸激酶区构象发生改变，激活了它的激酶活性。激活了的受体与细胞核中组蛋白作用，使组蛋白磷酸化，组蛋白构象发生改变，组蛋白八聚体结构解散，DNA的复制和一些特定基因的转录开始，细胞进入有丝分裂直至细胞增殖。

FGF也抑制前脂肪细胞的转化，这是一种直接抑制作用，而不是通过持续的促分裂作用来间接抑制的。在1 ng/mL浓度时，FGF抑制TA1前体脂肪细胞的早期标志物表达而不引起细胞的增殖，在10ng/mL浓度时，甚至可以逆转成熟脂肪细胞为前脂肪细胞。但也有人报道一种加入10ng/mL FGF的合成培养基，能够支持大鼠的前脂肪细胞的增殖和分化。

1．6前脂肪细胞因子-1(Pref-1)：Pref-1是含有EGFR的一种跨膜蛋白，在细胞外区域含6个EGF样结构序列，可形成可溶性的活性因子，通过抑制p42／p44 MAPK通路，阻断IGFR的信号转导，抑制前脂肪细胞的早期分化，以膜结合或蛋白水解的可溶性的形式存在，大量表达于前脂肪细胞，而在成熟的脂肪细胞中缺如，它与前脂肪细胞未分化状态有关。过表达Pref-1能抑制Cb EBP2A和PPAR2r的表达从而强有力的抑制脂肪细胞的分化，Pref-1在373-L1细胞上过度表达Pref-1可抑制C／EBPa和PPARγ的表达，从而抑制分化。Pref-1的膜外成分已被分离命名为FA1(为SOKD的可溶性成分)，对3T3-L1细胞的分化有抑制作用，Pref-1的其他成分则无此作用。从前体脂肪细胞分化起始到形成成熟的脂肪细胞，Pref-1的表达量逐渐下降以至于消失，说明Pref-1基因的表达参与了前脂肪细胞表型的维持，是目前唯一知道完全负面调控前脂肪细胞分化的基因。

2　对脂肪细胞增殖分化有影响作用的其他因素

2．1具有促进作用的因素

2．1．1胰岛素(insulin)：最早发现体外培养前脂肪细胞的增殖分化需要胰岛素，胰岛素可以提高前脂肪细胞的分化率，胰岛素在前脂肪细胞转化中起相当重要的作用，它既有本身促进脂肪的积聚又有支持其他药物的脂肪积聚作用。此外它还具有强大的抗细胞凋亡活性。在1mg(高浓度)胰岛素下，3T3-L1前脂肪细胞形成单层，4天以内加入糖皮质激素和MIX在12～24天内诱发最大量的脂肪转化：在1ng(低浓度)胰岛素下脂肪转化率降低，只有在生长激素(growth hormone，GH)或IGF-I和EGF)加入到培养基后再加入糖皮质激素和MIX才能得到最大的转化。

2．1．2前列腺素(PGI)：PG122能强烈促进前脂肪细胞的增殖和向成熟脂肪细胞转化，前脂肪细胞上有PGl22受体，成熟脂肪细胞上有前列腺素E22(Prostaglandin E22，PGE22)受体，PG122与受体结合升高环磷腺苷(cyclic adeno sinemonopho sphate，cAMP)及Ca²⁺浓度，从而引起前脂肪细胞的分化，使前脂肪细胞呈增生态。PGE22受体结合后降低cAMP浓度，稳定成熟脂肪细胞，有抗脂溶的作用，也有使脂肪组织增生肥大的作用。PG121对两种受体都能作用，呈现上述两种作用之和。

2．1．3糖皮质激素：多年以来，糖皮质激素也被用来

诱导前脂肪细胞和原始脂肪细胞的分化，最常见的是地塞米松，它通过激活糖皮质激素受体而发挥作用，并减少前脂肪细胞因子1的表达，从而诱导前脂肪细胞的分化。多数哺乳动物前脂肪细胞的有效分化离不开该激素的作用。

2．1．4油酸：油酸为单不饱和脂肪酸，PPARγ是一种成脂因子，它属于核激素受体亚族，与核受体家族中大多数成员一样，其活性由配体调节，它在前脂肪细胞中不表达，但在脂肪分化过程中表达，并先于大多数脂肪基因的表达。有研究证实，油酸能促进脂肪细胞PPARγ、C／EBPα及脂蛋白脂酶(LPL)mRNA的表达，表明油酸可作为脂肪细胞诱导分化的促进剂。研究发现，油酸刺激SW872前脂肪细胞可使PPAR2γ2与C／EBP2αmRNA表达升高，并且随着诱导分化时间延长，两者表达进一步增加，均在诱导分化72 h时表达最高，分别是诱导分化前的14．15倍和14．82倍，此时SW872前脂肪细胞达到最好分化效果。研究结果表明，0．6 mmol／L油酸刺激72h，能成功地将SW872前脂肪细胞诱导分化为典型成熟脂肪细胞，且具有诱导分化因子单一、分化时间短、分化率高等优点。

2．1．5环磷腺苷(cyclic adeno sinemonopho sphate，cAMP)：cAMP早期的研究表现在培养的前脂肪细胞株中加入磷酸二脂酶抑制剂MIX可增强分化，并且合成的cAMP拟似剂可代替MIX的作用。联合应用cAMP、胰岛素和DEX可能产生最大的分化作用。MIX还能升高CO EBPB的水平并诱导转录因子CREB的表达，CREB对373-L1细胞的脂肪形成是必须而充分的条件。SP1是介导抑制启动子的转录因子，MIX和cAMP可减少SP1水平，从而增强转录，促进前脂肪细胞的分化。

2．2具有抑制作用的因素

2．2．1 Cb EBP未分化蛋白(CUP)：CUP亦称为转录因子AP22A，是在分析CbEBP2A基因启动子的抑制元件时发现的。CUPOAP2A在前脂肪细胞中高表达并特异性作用于CbEBP2A启动子的CUP位点74，分化刺激使CUPO3AP22A蛋白水平下降，并激活与DNA的结合导致CO EBP2A表达增加，从而抑制前脂肪细胞的分化。

2．2．2维甲酸(Retinotic Acid，RA)：RA也是一种脂肪细胞分化的抑制剂，在它存在的情况下，维甲酸受体(RAR)直接抑制了CO EBP2B的活性。已知RAR和PPAR r一样都以RXR二聚体的模式存在，当有维甲酸存在时，RXR2RAR二聚体比RXR2PPARr二聚体更易形成，因此阻断了PPARr的作用。

2．2．3其他因素：二十二碳六烯酸，DHA对脂肪细胞增殖分化有一定抑制作用，高剂量DHA(160μmolPL)可显著减少细胞内脂肪的合成、抑制脂肪细胞分化，PPARγ2 mRNA表达量的下降可能是DHA抑制细胞分化的部分原因。内皮素21、干扰素2r(INF2r)、白介素21B(IL-21B)等对前脂肪细胞的增殖和分化均有抑制作用。

2．3具有双重作用的因素：全反式维甲酸(all trans Retinoic Acid，ATRA)对前脂肪细胞的分化具有双重作用。ATRA是维生素A在机体内的氧化代谢产物，是一种脂溶性小分子，能够与细胞核上的两种受体维甲酸受体(Retinoic Acid Receptor，RAR)和维甲酸X受体(RetinoidX Receptor，RXR)结合，发挥其生物学作用，调节细胞的增殖、分化与凋亡。但是，ATRA对前脂肪细胞增殖与分化的影响不同试验得到的结果却不相同，有些结果甚至完全相反。Kamei等证明ATRA能够抑制前脂肪细胞分化，其抑制效果与A7RA的加入时间和处理时间有关。但Sofonova等却发现ATRA能够促进前脂肪细胞的增殖与分化。提示可能其对前脂肪细胞有双重作用。

低浓度的ATRA促进前脂肪细胞的增殖，高浓度的ATRA抑制前脂肪细胞的增殖，国内陈国柱等用MTT法检测结果表明，在整个大鼠脂肪细胞培养过程中10^-4mol／L ATRA显著抑制前脂肪细胞的增殖。朱晓海等也发现2．5×10^-5～2×10^-4 mol／L的维生素A能够抑制前脂肪细胞的增殖，其中2×10^-4mol／L的维生素A几乎能够完全抑制前脂肪细胞的增殖。10^-5和10^-6mol／L ATRA在处理4天后。才显著抑制前体脂肪细胞的增殖。Stone等也发现用10^-6mol/L ATRA处理3 T32L1前脂肪细胞2天，细胞的增殖没有受到影响，不同浓度的ATRA对前脂肪细胞的增殖具有相反的作用，其原因可能是高浓度(10^-6～10^-4mol／L)的ATRA对细胞的生长具有毒副作用。从而抑制其增殖：而低浓度(10^-8～10^-7mol／L)的ATRA与ATRA生理浓度(10^-10～10^-8mol／L)接近，能够起到促生长激素的作用，从而促进前脂肪细胞的增殖。研究发现，10^-4mol／L、10^-5mol/ L和10^-6mol/L ATRA抑制大鼠前脂肪细胞的分化，而10^-7mol／L 和10^-8mol／L ATRA则促进前脂肪细胞的分化。前脂肪细胞的分化是一系列脂肪细胞分化标志基因顺次表达的过程，主要受一系列转录因子的调控，其中过氧化物增殖体激活受体γ(peroxisome proliferators 2acti-vated receptorγ PPARγ)和CAAT增强子结合蛋白α(CCAA T／enhancer binding pro2teineα C／EBPα)在前脂肪细胞的分化过程中具有重要调控作用。Xue等发现，ATRA能够与RAR结合，通过抑制PPARγ和C／EBPα的表达来抑制前脂肪细胞的分化。因此，ATRA对前脂肪细胞分化的影响可能与ATRA对PPARγ和C／EBPα表达的调控有关。PPARγ、RAR和RXR都位于细胞核上，属于维甲酸／甾体激素／甲状腺素核受体超家族。ATRA对前脂肪细胞分化的影响与PPARγ、RAR和RXR三者之间的平衡有关。高浓度(10^-6～10^-4mol／L)的ATRA可能是通过促进RAR／RXR的形成，抑制PPARγ／RXR的形成，从而抑制前脂肪细胞的分化；而低浓度(10^-8～10^-7mol／L)的ATRA可能有助于PPARγ／RXR的形成，从而促进前脂肪细胞的分化。

3　其他因素

对其他因素的研究也是刚刚起步。例如丁酸钠可在3T3前脂肪细胞亚单层时抑制其快速增殖，使其达到“生长停顿”状态而促进其向脂肪细胞的转化。百日咳毒素可增强由地塞米松+胰岛素+M IX诱导的鼠的前脂肪细胞的分化。GH能诱导多种体外培养的前脂肪细胞株的分化，但对培养的原代前脂肪细胞不但无效反而有抑制分化的作用。另外，甲状腺素等都在体外影响了脂肪的形成，还有报道中国传统中药地黄中得到的粗提取物TCM具有抑制脂肪细胞分化的作用，其抑制环节可能在转录水平起作用，还有一些维生素、脂肪酸、胶原纤维、血清中的一些成分等对脂肪细胞的增殖与分化均有影响。

总之，由于脂肪细胞间质较少而较易遭受损伤，在众多的自体移植材料中效果最不稳定，存在吸收率高达50％的问题，如何提高脂肪细胞的增殖及分化能力，使其达到临床应用要求是整形外科中的一个重大课题。因此前脂肪细胞的体外培养及理论的发展有助于阐明移植过程中各种处理因素对移植细胞活力及长期存活的影响，从而指导我们选择适当的处理措施以利于脂肪的移植。另外，当前培育多能干细胞并诱导其定向分化为脂肪组织是脂肪组织工程的研究课题。而研究如何提高细胞的分化增殖能力诱导多能干细胞分化和提取脂肪前细胞并将其应用于缺损的自体组织修复，便成为一个脂肪组织工程学中的核心问题，虽然对多能干细胞脂肪细胞分化增殖的机理和调控方式还尚未阐明，但随着对前脂肪细胞分化及增殖影响因素的进一步研究必然使前脂肪细胞分化的机理及调控更加清晰，从而给脂肪细胞工程学的研究带来新的启示。

编辑／李阳利

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。