姜黄素干预耐吉非替尼肺腺癌细胞上皮间质转化的影响及相关机制的研究

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[摘要] 目的 探讨姜黄素对耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD细胞的生物学特性影响以及干预其上皮间质化过程（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）的相关机制。 方法 采用体外姜黄素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD细胞；分别通过形态学、MTT法、transwell实验检测经姜黄素干预的耐药细胞株的形态特征、药物敏感性和侵袭转移能力的变化；通过Western blot实验检测波形蛋白、上皮钙粘附分子在药物作用后的表达差异以及PI3K/AKT/mTOR信号通路中相关蛋白 AKT、mTOR的变化情况。 结果 与人肺腺癌PC9细胞比较，PC9/ZD耐药细胞株呈间质样细胞表型；与亲代PC9/ZD细胞比较，经姜黄素作用后的PC9/ZD细胞对吉非替尼敏感性明显增强，转移能力减弱（75.67±8.82 vs 103.67±13.67）；侵袭能力减弱（17.22±3.63 vs 59.89±8.19）；波形蛋白表达下调（1.07±0.23 vs 1.28±0.28），上皮钙粘附分子表达上调（0.82±0.27 vs 0.29±0.11）；AKT、mTOR磷酸化减弱（0.20±0.05 vs 0.63±0.17，0.72±0.25 vs 1.10±0.19）。 结论 姜黄素可以通过阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路而明显干预耐吉非替尼肺腺癌细胞上皮-间质转化过程。

[关键词] 肺腺癌；吉非替尼耐药；上皮间质转化；生物学特性；姜黄素

[中图分类号] R285.5；R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）32-0001-04

吉非替尼作为一种常规治疗肺癌的化疗药物，在临床上有着不错的疗效，但还有很多肺癌患者会出现原发性耐药或继发性耐药的现象。已有研究表明肿瘤细胞发生上皮间质转化是其获得耐药能力的重要因素之一[1，2]。目前，姜黄素公认为是姜黄中最有效和最丰富的活性成分之一。一方面，姜黄素的抗炎、抗凝、抗氧化等作用不断被人们所证实[3]；另一方面，姜黄素的抗肿瘤机制也成为热点[4]。本研究通过体外姜黄素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD细胞，对其进行分子生物学特性的检测，分析其干预EMT过程的相关机制，旨在为进一步研究姜黄素干预肺腺癌耐药细胞发生EMT时所涉及的相关转录因子或相关通路打下基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料

①吉非替尼（Gefitinib）（阿斯利康制药有限公司产品）；②DMEM培养基、胎牛血清（Thermo公司产品）；③胰酶、PBS溶液（Hyclone公司产品）；④人结肠癌PC9细胞株（南京凯基生物科技发展有限公司）；⑤人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD细胞株（同济大学医学院提供）；⑥甲基偶氮唑蓝（MTT）、山羊抗兔IgG二抗、β-actin（biosharp公司产品）；⑦Matrigel胶、transwell小室、培养瓶、离心管（美国CORNING公司）；⑧E-cadherin、Vimentin、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、GAPDH一抗（Abcam公司）。

1.2 细胞形态学

采用倒置相差显微镜（OLYMPUS 200×）观察人肺腺癌PC9细胞株和人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD细胞株。

1.3 常规细胞培养

将处于对数生长期人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD细胞株接种至5 cm×5 cm大小的培养瓶，在37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞铺满培养瓶80%左右进行传代。可将细胞冻存在-80℃的超低温冰箱中，解冻后细胞活力正常。

1.4 吉非替尼对细胞抑制率的测定

消化离心正常生长的耐吉非替尼PC9/ZD细胞株，并调整细胞浓度为3×104个/mL，在96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液（边缘孔用无菌PBS填充）平均分为对照组和实验组，均加入用稀盐酸溶解过滤后浓度为10 μg/mL的吉非替尼药物溶液，调整每孔吉非替尼浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL，并在实验组的小孔中加入姜黄素（Cur），并调整每孔Cur含量为60 μmol/L。设置4个复孔。继续培养48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL；置于培养箱4 h后吸去上清液，每孔加DMSO 150 μL，振荡3 min；采用全自动酶标仪（美国Bio-Tex）检测波长为490 nm的吸光度（OD值）。计算抑制率，公式为=（1-实验组/对照组）×100%。

1.5 transwell实验检测细胞转移和侵袭能力

①转移实验：消化离心正常生长的耐吉非替尼PC9/ZD细胞株，调整细胞浓度为5×104个/mL，该组为对照组；向细胞悬液加入Cur，使Cur含量为60 μmol/L，细胞浓度也为5×104个/mL，该组为实验组；然后在每个transwell小室的上室中加入200 μL两组细胞悬液，同时下室中加入含10%胎牛血清的DEME培养基500 μL；放置于培养箱中常规培养24 h后小心吸去上下小室中的液体，并倒扣于滤纸上2 min；除去上室中未穿出的细胞；室温固定15 min（4%多聚甲醛）；染色20 min（0.1%结晶紫染色液）；风干后觀察、200倍镜下拍照和计数（每个小室随机选取5个视野）。设置3个复孔。②侵袭实验：先在每个transwell小室的上室加入事先4℃过夜解冻并用DEME培养基稀释6倍的Matrigel胶60 μL。细胞悬液密度变为8×104，其余步骤同转移实验。

1.6 Western blot实验检测细胞蛋白表达

常规培养的PC9/ZD细胞为对照组。预用含Cur含量为60 μmol/L的培养基培养48 h的PC9/ZD细胞为实验组。采用裂解液（PMSF∶RIPA=1∶100）提取细胞总蛋白。蛋白浓度是由RIPA裂解液调整为5 μg/μL，然后使蛋白高温下变性。配制分离和浓缩胶浓度为5%和10%，然后用恒压100 V进行电泳1 h，待电泳结束后进行转膜，转膜条件为冰浴、恒流2 h。封闭将转膜后的PVDF膜在4℃过夜条件下进行一抗处理。次日洗膜3次，进行二抗处理，37℃、1 h。再次洗膜3次用ECL显色后采用Quantity One软件（Bio-Rad）进行半定量比较分析。

1.7 统计学处理

采用SPSS16.0统计軟件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，并进行两独立样本的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞株形态

倒置相差显微镜（OLYMPUS 200×）直接观察人肺腺癌PC9细胞株和人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD细胞株。在200倍镜下观察发现，PC9细胞表现为上皮样形态，细胞大小均匀，为立方形或圆形；而PC9/ZD细胞株表现为间质样形态，细胞大小不一，甚至为多边形，细胞间距增大，并且有明显的伪足（封三图1）。

2.2 吉非替尼对两组细胞的抑制率比较

吉非替尼对两组细胞抑制效果见表1，并以吉非替尼浓度为横坐标，细胞抑制率为纵坐标，绘制图表（封三图2）。结果显示随着吉非替尼浓度增加，吉非替尼对两组细胞的抑制作用逐渐增强；并且在同样药物浓度作用下，实验组抑制率明显高于对照组（除1.0 μg/mL）（P<0.05）。

2.3 对照组与实验组转移能力和侵袭能力比较

转移和侵袭实验中，对照组穿过小室细胞数分别为（103.67±13.67）和（59.89±8.19）。实验组穿过小室细胞数分别为（75.67±8.82）和（17.22±3.63），表明姜黄素可以明显干扰人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD细胞株转移（t=2.77，P=0.011）和侵袭能力（t=2.41，P=0.016），见封三图3。

2.4 两组EMT相关蛋白表达及PI3K/AKT/mTOR信号通路p-AKT、p-mTOR比较

Western blot 实验结果显示，与对照组比较[蛋白相对含量E-cadherin和Vimentin分别为（0.29±0.11）和（1.28±0.28）]，实验组的E-cadherin表达上调[蛋白相对含量为（0.82±0.27）]，Vimentin表达下调[蛋白相对含量为（1.07±0.23）]（图1），表明姜黄素干预上皮间质化的过程，使得上皮标志蛋白表达上调，间质标志蛋白表达下调。另一方面，相比于对照组[蛋白相对含量p-AKT和p-mTOR分别为（0.63±0.17）和（1.10±0.19）]，实验组的p-AKT[蛋白相对含量为（0.20±0.05）]、p-mTOR[蛋白相对含量为（0.72±0.25）]也呈现低表达的状态（图2），说明姜黄素阻断PI3K/AKT/mTOR 信号通路，进而改变上皮间质转化的过程。

3讨论

肺腺癌的治疗是一个多学科综合治疗的过程，包括手术、化疗和靶向治疗等。吉非替尼作为治疗肺腺癌的临床一线化疗药物应用十分广泛，主要从三个方面发挥药理作用：①竞争EGFR-TK催化区域上Mg-ATP结合位点，阻断其信号传递；②抑制有丝分裂原活化蛋白激酶的活化，促进细胞凋亡；③抑制肿瘤血管[5]。但临床上常发生肿瘤细胞对其产生耐药的现象从而导致化疗失败和预后不良[6]。肿瘤细胞的多药耐药（MDR）可分为原发性耐药和获得性耐药两种类型[7]。

目前，普遍认为肺腺癌的转移和侵袭过程以及获得耐药能力的过程中均可能与EMT有关。李优等[8]研究表明，通过干预PI3K/AKT/mTOR信号通路可以使EMT相关的E-钙粘蛋白、波形蛋白表达发生改变，从而减弱经TGF-β1诱导的肺腺癌细胞侵袭和转移能力。肿瘤细胞发生上皮间质转化时，一些经典的信号传导通路已经被证实，如HGF/c-Met信号转导通路、转录因子Snail家族、β-连环蛋白通路、β-连环蛋白与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途径等[9-11]。此外还有学者研究发现，肿瘤细胞发生转移侵袭与其发生EMT时肿瘤细胞的基质金属蛋白酶表达上调、改变细胞微环境有关[12]。由此可见，通过干预肿瘤细胞EMT的发生能够成为治疗癌症的新方向。

姜黄素可以通过多种途径干预肿瘤细胞的生物学行为，如 Wnt/β-catenin 信号传导通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、细胞核转录因子-κB（NF-κB） 和STAT-3 信号通路等[8，13，14]。庞慧芳等[15]通过实验发现姜黄素能够逆转TGF-β1诱导的胰腺癌 PANC-1 细胞的EMT过程，降低胰腺癌的恶性程度从而达到治疗的目的。姜黄素的抗肿瘤作用越来越被重视。美国国立癌症研究所已经将其列为第三代抗癌预防药，因为其治疗效果显著、不良反应少、安全性高等特点，在日本广泛应用[16]。本实验结果显示，相比于亲代耐药细胞，经姜黄素处理的耐吉非替尼肺腺癌细胞对吉非替尼的敏感性明显改善；转移和侵袭能力也相应地减弱；上皮间质化标志蛋白Vimentin表达下调，E-cadherin表达上调。上述结果均说明姜黄素对耐吉非替尼肺腺癌生物学行为的改变甚至逆转上皮间质化的过程。

在肿瘤发生发展的过程中，PI3K/AKT/mTOR信号传导通路扮演着重要角色[17]。在多种恶性肿瘤细胞中均能发现PI3K/AKT/mTOR信号传导通路处于异常激活状态，与恶性肿瘤的各种生物学行为密切相关[18]。因此，针对该信号通路的研究和靶向药物的应用成为热点。有研究发现可以通过使PI3K/AKT/ARK5信号通路处于活化状态促进Snail蛋白进细胞核从而使细胞发生上皮间质化[19，20]。本实验结果显示，相比于亲代耐药细胞，姜黄素改变耐吉非替尼肺腺癌细胞的AKT、mTOR蛋白磷酸化。上述结果同时与Vimentin表达下调、E-cadherin表达上调相吻合，共同说明经姜黄素处理后，耐吉非替尼肺腺癌上皮间质化的过程被阻断甚至逆转。

结合国内外相关文献和实验结果提示姜黄素对耐吉非替尼肺腺癌上皮间质化有明显作用，为下一步实验提供了理论基础，进一步研究分子机制，通过基因检测等其他手段明确姜黄素药理作用与EMT的内在联系，为逆转EMT以及抑制肿瘤发生发展提供新的证据。

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（收稿日期：2016-07-09）