人参内生菌B69菌株抑菌物质特性的研究

材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株B69由笔者所在课题组从人参根中分离得到，经刘学周等鉴定为死谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）[7]。活性指示菌根腐病病菌，由吉林农业大学农学院植物病理教研室提供。

1.1.2 供试培养基 供试细菌的保存和培养使用营养琼脂（NA）培养基;供试细菌液体发酵培养使用营养肉汤（NB）培养基;病原真菌分离培养使用马铃薯葡萄糖（PDA）培养基。

1.1.3 试验时间地点 菌株抑菌物质特性试验于2017年4—7月在吉林农业大学药用植物实验室进行。

1.2 抑菌物质粗提物的制备及抑菌活性测定

B69菌株的发酵液在4 ℃、10 000 r/min条件下离心 20 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，得到抑菌物质粗提液，备用。抑菌活性用平板扩散法测定。

1.3 抑菌物质粗提物稳定性的测定

温度、pH值、蛋白酶、紫外线、反复冻融等稳定性试验参考文献[8]。

1.4 有机溶剂萃取物制备及其抑菌活性

取4支试管加抑菌物质粗提液，向其中分别加入等体积的有机溶剂（三氯甲烷、乙醚、乙酸乙醚、丙酮）进行萃取。待萃取液分层后，将水相与有机相进行分离，水相部分经 0.22 μm 微孔滤膜过滤。分别测定水相和有机相提取液的抑菌活性，以有机溶剂为空白对照，试验重复3次。72 h后测定其对根腐病病菌的抑菌圈大小。

1.5 抑菌蛋白成分的提取及其抑菌活性检验

1.5.1 硫酸铵沉淀法 在抑菌物质粗提液中加入硫酸铵，使其最终饱和浓度分别达到30%、40%、50%、60%、70%、80%，混匀，于4 ℃静置24 h。以饱和浓度为80%的培养液作为对照。在4 ℃、10 000 r/min条件下离心20 min，分别收集上清液和沉淀，沉淀溶于缓冲液中，测定沉淀和上清液的抑菌活性。

1.5.2 低温乙醇沉淀法 将无水乙醇提前放入冰箱进行预冷处理。在0 ℃冰浴中向抑菌物质粗提液中缓慢加入乙醇使其在溶液中的终浓度分别为50%、60%、70%、80%。于 4 ℃ 静置6 h以上，在4 ℃、10 000 r/min条件下离心20 min，分别收集沉淀和上清液，将沉淀溶于磷酸盐（PBS）缓冲液中，所得沉淀即为蛋白粗提液。测定上清液和沉淀的抑菌活性，以浓度为80%的乙醇培养液作同样的处理为对照。取乙醇上清液和沉淀溶解液各1.5 mL，在4 ℃水浴中加热20 min后，测定抑菌活性。

1.6 脂肽粗提取物的制备及其抑菌活性检验

取10 mL NA发酵上清液，用6 mol/L HCl调节pH值至2.0，4 ℃静置12 h，10 000 r/min离心20 min。所得上清液用NaOH调节pH值为中性后4 ℃保存备用。将沉淀用甲醇溶解，抽滤3次，合并滤液，旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，所得干燥样品用PBS缓冲液（0.02 mol/L，pH值为7.2）定容至10 mL，经0. 22 μm滤膜除菌，即得脂肽粗提物。检测脂肽粗提液和上清液的抑菌活性，以发酵上清液为阳性对照，以无菌PBS缓冲液为空白对照，试验重复3次。

1.7 胞外多糖的提取及测定

1.7.1 提取过程 将B69菌株发酵液稀释3倍，在 10 000 r/min 条件下离心10 min，弃菌体，收集离心液。以Sevag法去除蛋白质[9]，处理过程如下：由正丁醇和三氯甲烷以1 ∶4的体积比配制Sevag液，将其按4 ∶1的体积比加入离心液中，振荡25 min，6 000 r/min离心10 min，弃沉淀，反复处理3次，得到去除蛋白的离心液。向离心液中加乙醇来沉淀多糖，以空白培养液作同样处理为对照。用BaCl2溶液检测是否将SO42-彻底去除，用碘-碘化钾反应检测是否将培养基中的淀粉彻底去除。

1.7.2 葡萄糖标准曲线的绘制 葡萄糖标准曲线的绘制参考文献[10]。

1.7.3 多糖样品的测量 将上述获得的粗多糖沉淀溶于水，定容至100 mL，取2 mL稀释的待测样品，按照得到的标准回归方程测定多糖的含量，再进一步计算出样品的多糖含量。

1.7.4 多糖质量的检测 用α-萘酚反应、茚三酮反应、考马斯亮蓝反应、双缩脲反应、斐林试剂反应、三氯化铁反应等试验检测多糖的质量。

1.8 菌体内毒素的提取

采用热酚水法和超声波破碎法提取B69菌株菌体内的毒素。将200 mL振荡培养48 h的B69菌株菌悬液经 10 000 r/min 离心25 min，沉淀菌体，菌体用40 mL 90%苯酚水溶液（90%苯酚与水的体积比为1 ∶1）溶解，于68 ℃反应 1 h，澄清后取上清液于透析袋内，用聚乙二醇20000浓缩，透析袋内残留的固体用适量灭菌水溶解即为细菌的脂多糖液，或将菌体用超声波破碎仪完全破碎后，离心取上清液，分别测定脂多糖液和上清液的抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 B69菌株抑菌物质粗提液的稳定性

2.1.1 热稳定性 由表1可知，经40 ℃处理后，抑菌物质的抑菌活性完全没有受到影响。经60、80 ℃处理30 min后，抑菌物质的抑菌活性也都保持在80%以上。100 ℃处理30 min后，抑菌物质的抑菌活性为61.7%。在120 ℃处理后，抑菌物质完全丧失了活性。

2.1.2 pH值稳定性 B69菌株抑菌物质粗提液在pH值为2～10条件下的抑菌圈直径如表2所示，抑菌物质适宜的pH值范围为5～8，其相应的抑菌圈直径为31.5～36.3 mm。在强酸、强碱条件下，抑菌物质的活性受到影响但不丧失。

2.1.3 蛋白酶稳定性 经胰蛋白酶（20、50、100、500 μg/mL）、蛋白酶K（20、50、100、500 μg/mL）处理后，B69菌株抑菌物质粗提液对根腐病病菌的抑制作用无明显差异，与CK相比也没有明显差异。说明蛋白酶对抑菌物质的活性没有明显影响（图1）。

2.1.4 紫外线、反复冻融对抑菌活性的影响 经50 W紫外线灯照射24 h后， B69菌株抑菌物质粗提液的抑菌活性与对照组相比不存在明显差异，说明紫外线对B69菌株所产生的抑菌物质的活性没有影响。反复冻融10、15、20次对B69菌株抑菌物质粗提液的抑菌效果也没有明显影响。

2.2 有机溶剂萃取物抑菌活性

由表3可知，用乙醚、乙酸乙酯对粗提液进行萃取，得到的物质对根腐病病菌没有抑菌活性，而水相部分仍具有明显的抑菌活性。由三氯甲烷、丙酮萃取得到的物质具有一定的抑菌活性，其水相部分也具有一定的抑菌活性。结果显示，B69菌株产生的抑菌物质可以由三氯甲烷、丙酮萃取得到。

2.3 抑菌蛋白成分提取的抑菌活性

2.3.1 硫酸铵沉淀法 B69菌株抑菌物质粗提液经不同饱和度的硫酸铵处理后，沉淀溶解液均丧失活性。当硫酸铵浓度达到70%时，上清液与沉淀溶解液全都失去活性。

2.3.2 低温乙醇沉淀法 由表4可知，当乙醇浓度逐渐增加时，沉淀溶解液的抑菌活性整体上逐渐增强，上清液的抑菌活性逐渐减弱。当乙醇浓度为60%、80%时，上清液的抑菌圈直径分别为31.2、18.0 mm，沉淀溶解液的抑菌圈直径分别为18.5、33.5 mm。由此可知，80%为最适沉淀浓度。100 ℃加热处理后，上清液的抑菌活性基本不变，而乙醇沉淀溶解液失去抑菌活性。

2.4 脂肽粗提取物的抑菌活性

菌株发酵上清液经酸化后能产生絮状沉淀，经超低温真空冷冻干燥后有淡黄色脂肽粗提物生成。抑菌试验结果表明，脂肽粗提液对人参根腐病病菌具有明显的抑菌效果，但抑菌效果略弱于发酵上清液（图2），说明发酵液中還存在其他抑菌活性成分。酸化沉淀后的发酵上清液无抑菌效果，说明酸沉淀法能有效提取发酵液中的抑菌活性成分。

2.5 胞外多糖的提取及测定

2.5.1 胞外多糖活性的测定 B69菌株抑菌物质粗提液经乙醇沉淀、Sevag法除蛋白、透析、浓缩等步骤后所得的多糖溶液呈无色透明状，测得pH值小于6，初步推断其为酸性多糖，取适量多糖溶液，加BaCl2溶液检验，无沉淀产生，说明SO42-已被去除，碘-碘化钾反应呈阴性，表明已将培养基中的淀粉彻底去除。抑菌试验结果表明，B69菌株的胞外多糖溶液具有抑菌活性，可产生不规则、不透明的抑菌圈（图3）。

2.5.2 多糖含量的测定 测定标准曲线得到回归方程D=4.236C-0.045（D为吸光度，C为多糖浓度），r2=0.999 0。根据标准曲线计算后得知，B69菌株胞外多糖粗提液中糖的含量为0.081 2 mg/mL。

2.5.3 多糖质量的检测 α-萘酚显色反应呈阳性，表示所含物质为多糖;茚三酮试剂、考马斯亮蓝、双缩脲反应均呈阴性，表明不含蛋白质及肽类物质;与斐林试剂反应呈阴性，表明不含游离单糖;与三氯化铁反应呈阴性，表明不含多酚类物质。

2.5.4 多糖纯度的测定 本试验所得糖的层析液浓度图呈单峰，因此可初步判定所提取的B69菌株胞外多糖为单一多糖成分。

2.6 菌体内毒素的提取

经热酚水法和超声波破碎法得到的提取物经测定均没有抑菌活性。

3 讨论与结论

1996年，死谷芽孢杆菌的研究就有了相关的报道，死谷芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的近亲[11]。张慧等从棉花根际分离出1株能有效拮抗棉花黄萎病病原菌的菌株[12]。林英等从醋糟中分离得到1株对立枯丝核菌，其对小赤霉病、西瓜枯萎病等病原菌都有明显的拮抗效果且具有广谱抑菌效果[13]。郝捷等研究指出，死谷芽孢杆菌胞外分泌物属于脂肽类，能够有效抑制菌丝生长和木霉孢子的萌发[14]。B69菌株属于死谷芽孢杆菌，对多种病原菌都有拮抗作用，对人参根腐病病菌、灰霉病病菌的拮抗效果尤为显著，但其具体作用机制有待研究。

本试验对人参内生菌B69菌株抑菌物质的特性进行了研究。稳定性试验结果表明，人参内生菌B69菌株产生的抑菌物质粗提液耐强酸强碱、对蛋白酶不敏感，紫外线照射和反复冻融对其活性没有明显影响。该菌株分泌的胞外抑菌物质可以被乙醇部分沉淀，但不能被硫酸铵沉淀。抑菌物质提取液经100 ℃处理后，部分失活，乙醇处理后的上清液耐高温。沉淀经100 ℃处理20 min后失活。从B69菌株中得到的粗脂肽提取物具有抑菌活性并且其胞外多糖也具有抑制根腐病病菌的作用，因此目前可知该植株可以至少产生2种抑菌物质。

本试验中得到的多肽具有抑菌活性，近年来，微生物来源的多肽被用于抗真菌病害方面的研究也有很大的进展，它与化学农药相比污染少、对环境友好，在农业生物防治领域具有广阔的应用前景。

近年来，在植物保护领域，多糖被用来诱导植物的抗性防卫反应，如诱导过氧化物酶和几丁质酶的积累，提高植物的抗病能力，或者直接抑制植物病原菌[15]，多糖研究正越来越多地引起人们关注[16]。本试验从B69菌株中提取出的胞外多糖能够抑制根腐病病菌的生长，极具研究价值。

本试验在对B69菌株开展抑菌活性研究的基础上，就其次生代谢产物中的抑菌活性成分也开展了初步研究，基本明确了抑菌活性物质的活性部位，这为菌株抑菌活性物质的分离纯化、结构鉴定及抑菌机制研究奠定了良好基础;另外，上述试验结果的获得也将有助于推动人参病害的生物防治。

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